冷冻鱼糜是将原料鱼采肉、漂洗、脱水后，加入糖类、多聚磷酸盐等抗冻变性添加剂，使其在低温下能较长时间保藏。白鲢因为具有分布广泛、产量高、价格低、肉质白等特点，已成为我国生产淡水鱼糜的主要原料。在冷冻鱼糜的贮藏过程中，脂肪氧化和蛋白质氧化是造成鱼糜品质劣变的重要原因，脂质氧化的次级产物会进一步促进蛋白的氧化。
肌原纤维蛋白（MP）是鱼糜中的主要蛋白，在不同氧化应激条件下，其结构会发生变化，进而对鱼糜制品的色泽、质构、水分状态等产生影响。MP的凝胶特性是鱼糜制品应用的重要基础，华中农业大学食品科学技术学院，国家大宗淡水鱼加工技术研发中心（武汉）的张海萍、余小月、刘友明*等主要以鲢鱼MP为对象，探究羟自由基为代表的脂质氧化产物对其凝胶品质的影响，以期理解鱼糜在贮藏过程中品质劣化的机理，从而实现对品质变化的量化监测和凝胶产品品质的控制。
1、氧化度对MP中巯基含量的影响
由图1可知，随着H2O2浓度升高，总巯基含量呈先升高后降低的趋势，在H2O2浓度为1.0 mmol/L时，达到最大值。当H2O2浓度为0.1～1.0 mmol/L时，在蛋白氧化过程中，一些活性巯基暴露到蛋白质表面，从而被检测出来。当H2O2浓度达到5.0 mmol/L时，过多暴露出来的巯基被一些自由基等活性基团氧化，生成了非二硫键类物质，导致总巯基含量降低。活性巯基含量的变化趋势较弱，在低浓度H2O2（0.5～1.0 mmol/L）的氧化条件下，蛋白的活性巯基含量变化不明显（P＞0.05），当浓度继续升高时，较高程度的氧化导致已经暴露的巯基与自由基等物质发生反应，从而降低了活性巯基的含量。
2、氧化度对MP凝胶质构特性的影响
由图2可知，随着H2O2浓度的升高，凝胶的凹陷深度不断降低，在低浓度（0.1～0.5 mmol/L H2O2）氧化时达到最大值，但氧化程度较高（1.0～10.0 mmol/L H2O2）时，凝胶的凹陷程度显著下降（P＜0.05）。适度氧化（0.1～0.5 mmol/L H2O2）的MP凝胶强度显著增强。当H2O2浓度高于1.0 mmol/L时，氧化蛋白的凝胶强度远小于较低程度氧化组的蛋白凝胶（P＜0.05）。当H2O2浓度达到5.0 mmol/L时，凝胶强度发生显著降低，其有序聚集形成凝胶的能力下降，不利于蛋白的凝胶网络结构形成。Fenton体系反应产生了一定量的羟自由基，氧化鲢鱼的MP，蛋白质结构展开暴露出的巯基形成了二硫键，对凝胶结构产生了有利影响。
3、氧化度对MP凝胶色度的影响
由表1可知，随着H2O2浓度升高，凝胶的白度呈现先增高后降低的趋势，在0.1 mmol/L和0.5 mmol/L H2O2氧化组中较高，分别为73.90和75.12，高于其他样品组（P＜0.05）。适度的氧化有助于改善蛋白凝胶的色泽，这可能是由于此时凝胶的持水性增强，样品变得透明有光泽。随着H2O2浓度升高，蛋白凝胶的亮度L*值有所增高，但当H2O2浓度较高（5.0～10.0 mmol/L）时，凝胶的亮度下降，这可能是羟自由基氧化生成的产物以及氧化过程中蛋白发生美拉德反应生成的物质颜色较暗所致。
4、氧化度对MP凝胶持水性的影响
由图3 可知，随着体系中H2O2浓度的升高，凝胶的持水性呈先升高后降低趋势，在较低浓度H2O2（0.1～0.5 mmol/L时）氧化时，蛋白凝胶的持水性达到极值（P＜0.05），当H2O2高于1.0 mmol/L时，蛋白凝胶持水性能降低（P＜0.05）。在H2O2浓度达到0.1 mmol/L时，蛋白凝胶的持水力达到最大值，为69.98%。当H2O2浓度从1.0 mmol/L升到5.0 mmol/L时，凝胶的持水性从65.19%下降到61.67%。说明过度氧化可能会导致蛋白的构象发生改变，蛋白的水合能力减弱是导致其持水力下降的原因。
5、氧化度对MP凝胶水分分布状态的影响
如图4所示，水分大体呈3 种状态分布，其中，弛豫时间在1～10 ms左右的水分被认为是结合水；弛豫时间在10～100 ms左右的水分被认为是不易流动水，这部分水含量的高低与鱼糜凝胶的持水性能相关；弛豫时间在100～1000 ms左右的水分被认为是自由水，它几乎不受束缚，可以自由移动。对数据进行反演后各实验组水分分布的占比P21、P22、P23见表2、3。随着体系中H2O2浓度的升高，MP凝胶中自由水的比例呈先降低后升高的趋势，在H2O2浓度为0.5 mmol/L时达到最小值。当H2O2浓度升高到10.0 mmol/L时，凝胶中的自由水含量显著高于其他组，对应结合水的含量较少，说明有部分结合水转化成自由水，对应MP凝胶的持水性下降，可能是由于氧化MP与水分的交联状态发生改变，此时MP凝胶中水分的流动性增强。
如图5所示，右侧的图例色条用于衡量不同水分子的质子密度：红色多的样品质子密度高，水分含量多。由图5可知，随着体系中H2O2浓度的升高，蛋白凝胶中的H + 质子密度呈先蓝移后红移的趋势，当H2O2浓度达到1.0 mmol/L时，质子密度图像中红色区域面积明显开始增大，说明此时样品中的长弛豫信号较强。结果表明经适度的羟自由基氧化的MP凝胶中的质子密度小于空白组样品，但是高氧化度的MP凝胶中质子的密度大于空白对照组，且质子的分布较为均匀，此时凝胶样品中的水分含量增加，但此时的持水性降低，说明凝胶的空间网络结构致密性降低，蛋白结合水分的能力减弱。
6、氧化度对MP凝胶微观结构的影响
由图6可知，随着体系中H2O2浓度的升高，蛋白凝胶的微观结构会发生显著变化。未氧化的MP凝胶结构较散，孔隙之间分布较不均匀，孔径大小不一，凝胶的网络结构较差。适宜浓度的H2O2（0.1 mmol/L和0.5 mmol/L）氧化MP时，凝胶的网络结构较为紧密，孔洞分布较为均匀，间隙较统一。但当体系中H2O2的浓度较高，超过1.0 mmol/L时，凝胶结构开始变差，孔洞分布密度不统一，结构中的孔洞不均匀，纤维网络的间隙变大。
由图7可知，样品之间孔隙率的差异不显著（P＞0.05），0.5 mmol/L H2O2氧化的蛋白凝胶的孔隙率较低（P＜0.05），说明此时形成了较致密的凝胶网络结构。对比样品的平均孔隙直径，空白组样品的平均直径为20.92 μm，随着氧化程度的加深，孔隙直径呈先降低后升高的趋势，在0.1 mmol/L时达到极值（P＜0.05），为12.58 μm；H2O2浓度为10 mmol/L时，样品中出现的孔隙直径最大（P＜0.05），为30.20 μm。较低程度（0.1～0.5 mmol/L H2O2）氧化条件下，蛋白凝胶结构中的孔隙较为致密，孔洞面积占比较少，直径小于空白组的蛋白凝胶（P＜0.05），体系中H2O2浓度继续增高（1.0～5.0 mmol/L H2O2）时，样品结构中的孔洞变大，凝胶结构的致密性降低。
7、羟自由基氧化蛋白的氧化位点分析
如图8所示，随着体系中H2O2浓度的增加，蛋白水解产生的片段数量减少。未氧化蛋白水解产生的肽段数为597 个，当H2O2浓度从0.1 mmol/L增加到10.0 mmol/L时，肽段数量从575 条减少到500 条。说明蛋白质发生了氧化聚集，掩盖了蛋白酶的水解位点，水解产生的肽段数量减少。Venn图可以直观地对比不同氧化程度被胰蛋白酶水解的产物中的共有肽段和独有肽段。各组样品蛋白中有327 种共有肽段，表明这些肽段未被羟自由基氧化修饰。在各酶解产物中，未氧化组蛋白的独有肽段有53 种，0.1 mmol/L H2O2组有48 种，0.5 mmol/L H2O2组有43 种，1.0 mmol/L H2O2组有27 种，5.0 mmol/L H2O2组有30 种，10.0 mmol/L H2O2组有33 种独有肽段，各组酶解产物中的肽段数量不同，说明氧化度对蛋白的酶解位点产生了影响。
将肽段与Uniprot数据库中的蛋白进行对比，可以确定其氧化位点，结果见表3。
结论
利用羟自由基氧化白鲢MP，适度的氧化（0.1～0.5 mmol/L H2O2）有助于改善MP凝胶的品质，体现为：凝胶的白度可以得到改善，凝胶强度增加，电镜观察到凝胶三维结构更加致密，凝胶中的孔洞分布更为均匀，也在一定程度上提高了凝胶的持水性能。但是当蛋白过度氧化（5.0～10.0 mmol/L H2O2）时，凝胶的结构变差，网络孔洞分布不均且表面积增大，造成了凝胶的持水性变差，凝胶强度大大减弱。羟自由基的氧化作用主要的修饰位点是甲硫氨酸和半胱氨酸，主要发生在肌球蛋白重链和肌动蛋白，位于肌球蛋白尾部的氨基酸比头部氨基酸更容易发生氧化修饰。这也在一定程度上为鱼糜凝胶品质的调控研究提供了基础。
通信作者简介
刘友明，中共党员，男，1975年9月出生，湖北荆门人，工学博士，教授，博士生导师，华中农业大学食品科学技术学院 副院长，国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心（武汉）和湖北省水产品加工工程技术研究中心固定研究人员。1997年7月获华中农业大学食品科学与工程学士学位；2000年6月获华中农业大学农产品加工及贮藏工程硕士学位；2010年6月获华中农业大学农产品加工及贮藏工程博士学位。2000年7月至今在华中农业大学食品科学技术学院工作，其中2013年6月至2014年6月赴美国俄勒冈州立大学做访问学者（合作导师Jae Won Park教授）。主要从事食品大分子结构及其功能特性、水产品加工保鲜理论与技术以及粮食深加工等方面的研究。主持和参与国家自然科学基金、国家科技支撑计划、湖北省重大科技攻关计划项目、湖北省研究与开发计划项目等各类科研课题共40余项。
第一作者简介
张海萍，硕士研究生，女，汉族，中共党员，硕士就读于华中农业大学食品科学技术学院，研究方向为水产品加工与贮藏。
本文《羟自由基氧化对鲢鱼肌原纤维蛋白凝胶特性的影响》来源于《食品科学》2023年44卷6期9-16页，作者：张海萍，余小月，程梦颖，熊善柏，刘友明。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220422-294。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
图片来源于文章原文及摄图网。
为构建多元化食物供给体系并兼顾生态环境保护，并形成以生物多样性保护促进食品生产的可持续性，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与北方民族大学、宁夏大学、皖西学院、宿州学院、滁州学院、黄山学院于 2023年5月13-14日在中国宁夏银川 共同举办“ 生态保护与食品可持续发展国际研讨会 ”。本届研讨会将围绕新资源食品挖掘、动植物、微生物可替代蛋白、食用菌等食物资源的开发现状、重要创新进展及存在的问题开展研讨，探讨未来食品发展方向，通过展示我国生态保护与食品可持续发展等领域的最新科研成果，搭建科研单位与企业产学研结合的平台，共同促进我国食品产业发展快速踏入新里程。
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
投稿网址：
https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
